Mit Hilfe der Sequenzierung lässt sich das Erbgut eines Menschen »auslesen«. Das Verfahren ist allerdings sehr komplex, zeitaufwendig und teuer. Zudem muss die Anzahl an Nukleinsäuren in einer Probe bekannt sein. Eine vom Fraunhofer FIT bereits vor einigen Jahren entwickelte Einzelmoleküldetektionsmaschine (EMDM) ist in der Lage, kleinste Mengen dieser Nukleinsäuren zu analysieren. Nun haben die Forscher die EMDM an das Next-Generation-Sequencing angepasst.

Für alle, die sich nicht an die entsprechenden Biostunden in der Schule erinnern können, hier eine kurze Erklärung der sogenannten »DNA-Sequenzierung«: Mit dieser Methode werden die Basenfolgen in der DNA bestimmt. Durch das Wissen, wie Andenin, Guanin, Cytosin und Thymin aufeinander folgen, lassen sich nicht nur Erbkrankheiten untersuchen und neue Wirkstoffe entwickeln, auch die generelle Lokalisierung verschiedener Erbinformationen auf der DNA ist somit möglich. Die DNA-Sequenzierung ist deshalb aus der biologischen Wissenschaft und Forschung kaum mehr wegzudenken. Aber: Das Untersuchen eines DNA-Strangs ist kompliziert und teuer. »Das liegt unter anderem daran, dass die Prozesse in einem Sequenzer hochexakt ablaufen müssen«, erklärt Benjamin Greiner vom Fraunhofer-Institut für Angewandte Informationstechnik FIT. Für die in einem Sequenzierautomaten ablaufenden chemischen Reaktionen sei es z.B. grundlegend zu wissen, wie viele Nukleinsäure-Moleküle in einer Probe vorhanden sind. »Da wir uns hier in der Regel aber nur im Bereich von wenigen Pikogrammen, also einem zehnbillionstel Gramm bewegen, ist die Zählung schwierig und fehleranfällig«, sagt Greiner. Hinzu kommt: Mögliche Fehler potenzieren sich. Denn nach heutigem Stand der Technik muss die Probe vor der Sequenzierung vervielfältigt werden, um genügend Material für die Massenbestimmung zur Verfügung zu haben. Erst dann haben Genetiker genügend Ausgangsmaterial, um weiterforschen zu können.

Einzelmoleküldetektionsmaschine zur Nukleinsäure-Analytik

Um Fehler auszuschließen oder gar ganz auf eine Amplifizierung verzichten zu können, haben Forscher am Fraunhofer FIT bereits vor einigen Jahren eine spezielle Einzelmoleküldetektionsmaschine (EMDM) entwickelt. Die EMDM nutzt ein hochsensitives, konfokales Mikroskop, dass ebenfalls am Institut entwickelt wurde. Es arbeitet mit dem Prinzip der Fluoreszenzdetektion. Die Biomoleküle werden also mit Fluoreszenzmarkern versehen und durch einen Laser zum Leuchten angeregt. Diese Art des Nachweises ist so empfindlich, dass die EMDM für die »Qualitätskontrolle« innerhalb der DNA-Sequenzierung prädestiniert ist. Sie misst und zählt, um die DNA-Konzentration in einer Probe zu bestimmen – und das extrem genau. Deshalb wird die EMDM von Laboren bereits erfolgreich eingesetzt.

Kalibrierungsarbeiten am Anregungsstrahlengang des EMDM-Gerätes. Bild: Fraunhofer FIT

Next-Generation-Sequenzierung

Die Integration der EMDM in die vollautomatisierten Prozesse in modernen Sequenzierungslaboren war jedoch schwierig. Das Gerät war wenig flexibel und wenig integrativ für die Prozesskette. »Weil Proben immer häufiger vollautomatisch auf dafür vorgesehenen Laborstraßen sequenziert werden, entwickeln wir nun ein EMDM-Benchtop-Gerät, das in den vollautomatisierten Laborstraßen des Next-Generation-Sequencing eingesetzt werden kann«, sagt Greiner. Neben der Weiterentwicklung bei der Hardware haben die Forscher aber auch die Exaktheit der Konzentrationsbestimmung nochmals signifikant gesteigert. »Im Benchtop-Gerät nutzen wir eine Bleaching-Korrektur, um die mit der Zeit schwindende Fluoreszenz von Molekülen auszugleichen«, sagt Greiner. Wie bei einem Ölbild, bei dem berücksichtig werden muss, dass die Farben mit der Zeit verblassen und so immer weniger Details zeigen, wird durch das Bleaching das Schwinden der Leuchtkraft, also die »Bleichrate«, mit eingerechnet, um die Massen weiter präzise bestimmen zu können.
Fertiggestellt werden soll ein marktreifes Gerät bereits Ende dieses Jahres.

Parallel dazu arbeiten die Forscherinnen und Forscher am Fraunhofer FIT aber auch an weiteren Einsatzmöglichkeiten der EMDM. Dann soll – neben der Qualitätskontrolle – auch die Identifikation von molekularen Biomarkern möglich sein. Mit Hilfe dieser Marker lassen sich mögliche Erbkrankheiten frühzeitig erkennen und etwaige Therapien gezielt ausrichten. Greiner rechnet damit, dass sein Team und er auch auf diesem Gebiet in einigen Jahren konkrete Erfolge vorweisen können.

(aku)

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